Strukturelle Biologie der Membranproteinkomplexe

Membranproteine sind für viele grundlegende Prozesse in der Zelle verantwortlich, u.a. Transport von Ionen und Metaboliten, Umwandlung von Energie und Weitergabe von Signalen. Sie werden auch mit vielen menschlichen Krankheiten in Zusammenhang gebracht. Ein Drittel des menschlichen Genoms codiert Membranproteine und zwei Drittel der modernen Medikamente zielen auf sie ab.  Dennoch stellen Membranproteine nur ungefähr 2% der bekannten Proteinstrukturen in der Protein Daten Bank (PDB) dar, weil sie sich bekanntlich nur schwer exprimieren, reinigen und für die kristallographische Strukturbestimmung mit Röntgenstrahlen kristallisieren lassen. Um unser Wissen über die Funktionen von Membranproteinen zu erweitern und die Entstehung relevanter Medikamente zu unterstützen, gibt es einen dringenden Bedarf nach einer strukturellen Beschreibung von weit mehr Membranproteinfamilien.

Wir sind seit vielen Jahren an der strukturellen Biologie von Membranproteinen interessiert, insbesondere jener aus dem Bereich der Bioenergetik. Die meiste Energie beim Menschen wird durch die mitchondriale Atmungskette in Form von ATP gebildet; diese Kette besteht aus mehreren Proteingruppen, die in Fettmembranen (KomplexeI-V) eingebettet sind.  Der bisherige Forschungsschwerpunkt lag auf Komplex I der Atmungskette, einem riesigen (bis zu 1 MDa) Enzym, das von zentraler Bedeutung für die Energieerzeugung in der Zelle ist. Mutationen in Untereinheiten von Komplex I führen zu vielen neurodegenerativen Krankheiten beim Menschen, und das Enzym ist auch an vielen häufigen Erkrankungen, z.B. Krebs, beteiligt. Wir haben alle bekannten Atomstrukturen von Komplex I bestimmt, anfänglich die Subkomplexe (4-7), dann das ganze Enzym (3) und zuletzt den Komplex I in Säugetieren, das größte, bis dato gelöste asymmetrische Membranprotein mit 78 Transmembranhelices. Diese Strukturen ermöglichten die Interpretation funktionaler Daten, die in den letzten 50 Jahren gesammelt wurden. Die große Komplexität des Enzyms (mit bis zu 9 Fe-S Clusters und vier Protonkanälen), die über seine Effizienz hinwegtäuscht, ist eines der faszinierendsten Naturwunder, weil die Redoxenergie über eine Entfernung von bis zu ~300 Å eingesetzt wird. Die Struktur des ganzen Komplexes deutet auf einen ausgeklügelten Mechanismus der Protonentranslokation hin, der mit weiträumigen Konformationsänderungen verbunden ist. Wir prüfen den Mechanismus mit strukturellen Studien, indem wir uns der modernsten Hard- und Software der Elektronenmikroskopie bedienen und sowohl Röntgen-Kristallographie und Einzelpartikel-Cryo-Elektronenmikroskopie einsetzen. Um die Mechanismen dieser molekularen Maschine vollständig zu verstehen, ergänzen wir die strukturelle Arbeit um lokale Mutagenese und verschiedene funktionelle Versuche mit einer Reihe von biophysikalischen Techniken. Außerdem erweitern wir unsere Studien um andere verwandte Komplexe wie z.B. Mrp Antiporters und membrangebundene Hydrogenase sowie andere interessante Membranproteine.

Unsere Studien werden das Wissen über redox- und konformationsgekoppelte Protonenpumpen vertiefen und die allgemeinen und besonderen Merkmale des molekularen Aufbaus in diesen komplizierten biologischen Maschinen erschließen, die menschlichen Entwicklungen häufig ähneln, aber sie in puncto Effizienz weit übersteigen. Die medizinischen Auswirkungen sind vielfältig, insbesondere für mit Komplex I verbundene Krankeiten, die die häufigsten genetischen Störungen beim Menschen ausmachen.

Kontakt

Leonid Sazanov

Institute of Science and Technology Austria (IST Austria)
Am Campus 1
A – 3400 Klosterneuburg

Tel: +43 (0)2243 9000-3026
E-Mail: sazanov@remove-this.ist.ac.at

CV und Publikationsliste

Postdocs und PhD Studenten richten Bewerbungen direkt an ihn.

Assistentin
Rita Six

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E-mail: rita.six@remove-this.ist.ac.at

Team

  • Alexej Charnagalov, Technical Assistant
  • Javier Gutiérrez-Fernández, Postdoc
  • Karol Fiedorczuk, Pre-doctoral Visiting Scientists
  • Kristina Lukic, Scientific Intern
  • Karol Kaszuba, Postdoc
  • James Letts, Postdoc
  • Julia Steiner, PhD Student
  • Margherita Tambalo, Pre-doctoral Visiting Scientists
  • Long Zhou, Postdoc

Ausgewählte Projekte

- Der Kopplungsmechanismus zwischen Elektronentransfer und Protonentranslokation in Komplex I. Komplex I bei Säugetieren hat eine Masse von ca. 1000 kDA und besteht aus 44 verschiedenen Untereinheiten (45 im Ganzen). Das prokaryotische Enzym ist einfacher (550 kDA, 14 konservative zentrale Untereinheiten), so dass wir es als „minimales“ Modell einsetzen. Es ist ein L-förmiges Molekül, das von einem wasserbindenden und einem wasserabweisenden Arm gebildet wird. Der Transfer von zwei Elektronen zwischen NADH und Quinon über sieben Fe-S Clustern im wasserbindenden Arm ist an die Translokation von vier Protonen durch die Membran gekoppelt. Wie diese zwei räumlich getrennten Prozesse genau gekoppelt sind, ist bisher noch nicht klar, obwohl die von uns bestimmte Struktur von Komplex I aus T. thermophilus darauf hinweist, dass sich entlang der Membran ausbreitende Konformationsänderungen beteiligt sein könnten.

Struktur des ganzen Komplex I aus T. thermophilus. Jede Untereinheit hat eine andere Farbe und die ungefähre Position der Membran ist eingezeichnet. Abbildung aus (3).

Wir untersuchen den Kopplungsmechanismus, indem wir die Röntgen-Strukturen des Komplex I in T. thermophilus bei unterschiedlichen Redox-Zuständen und mit verschiedenen gebundene Substraten vergleichen. Da Kristallkontakte Konformationsänderungen beschränken können, untersuchen wir auch solche Strukturen, indem wir die modernsten Methoden der Cryo-Elektromikroskopie (Detektoren für direkte Elektronen und statistische Filmverarbeitung) einsetzen. Wir arbeiten auch an der Nano-Kristallographie mit Free Electron Laser-Quellen (z.B. LCLS in Stanford), die zeitunabhängige Studien ermöglichen. Alle beobachteten Konformationsänderungen werden mechanistisch mit Hilfe von ortsgerichteter Mutagenese und funktionellen Studien interpretiert .

- Struktur von Komplex I bei Säugetieren. Obwohl wir die Struktur des bakteriellen Enzyms bestimmt haben, enthält Komplex I bei Säugetieren ca. 30 zusätzliche Untereinheiten mit weiteren ~500 kDa. Die Funktion dieser Proteine, die eine Hülle um die zentralen Untereinheiten bilden, ist nicht klar, aber viele davon bergen schädliche Mutationen. Mit Methoden der Cryo-Elektromikroskopie haben wir fast die  komplette Atomstruktur von Komplex I bei Säugetieren mit einer Auflösung von 3,9 Å festgestellt.

Struktur des mitochondrialen Komplex I bei Sägetieren. Gezeigt werden zwei Seitenansichten, wobei die zentralen Untereinheiten in Bakterien grau und die zusätzlichen Untereinheiten farblich gekennzeichnet sind. Abbildung aus (1).

Diese Struktur hat natürlich weit reichende Auswirkungen auf die Medizin, weil sie Einblicke in den Mechanismus von Komplex I, seine Gruppen, Reifung und Fehlfunktion gibt und detaillerte molekulare Analysen von krankheitsauslösenden Mutationen erlaubt. Wir beobachten mehrere verschiedenen Enzymkonstellationen, die mit aktiven/deaktiven Übergängen in Verbindung gebracht werden können und weiter erforscht werden, um einen allgemeinen Kopplungsmechanismus von Komplex I zu definieren.

- Komplex I und Erkankung. Komplex I ist an vielen menschlichen Erkrankungen beteiligt, weil es in der Energieerzeugung und dem Stoffwechsel zentral ist. Wir werden die molekulare Grundlage der herkömmlichen neurodegenerativen Störungen z.B. Lebersche hereditäre Optikusneuropathie (LHON) untersuchen und potenzielle Wege zu einer Behandlung identifizieren. Komplex I ist eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in den Mitochondrien, die zu geschädigter mtDNA führen können und möglicherweise eine Rolle in der Alterung spielen. Wir entwickeln Medikamente, die diese Schäden abschwächen. Es mehren sich die Hinweise, dass Komplex I über ROS-Signalgebung eine Rolle bei Krebs hat. Wir arbeiten mit der Pharmaindustrie und akademischen Partnern zusammen, um diese Rolle aufzuklären.

- Superkomplexe in der Atmung. In der mitochandrialen Membran existieren in vivo-Atmungskomplexe nicht isoliert, sondern zu riesigen "Superkomplexen" oder "Respirosomen" (bis zu ~2 Megadalton in Größe) organisiert. Der Grund dafür ist nicht bekannt. Wir haben mehrere Architekturen dieser Superkomplexe mit einem Cryo-Ektronenmikroskop (2) identifiziert. Wir beschreiben die Zusammensetzung und Umgebung aller aktiven Anlagen in den Enzymen (Komplexe I, III und IV). Es scheint, dass eine der Funktionen der Superkomplexe -  neben der Stabilisierung individueller Proteine - die Verhinderung der überschüssigen Produktion von Sauerstoffradikalen ist. Derartige Radikale sind für die DNA und due Proteine in der Zelle schädlich und könnten einer der Gründe fürs Altern darstellen.

Die Architektur des “Respirasoms”. Komplex I ist blau, Komplex III grün und Komplex IV magentafarben. Redox-Kofaktoren sind hervorgebhoben. Beruht auf der durch die Cryo-Ekektronenmikroskopie mit einer Auflösung von 5,8 Å bestimmten Struktur (2).

- Andere Membranproteinkomplexe. Wir interessieren uns für die Struktur und Funktion von membranbegrenzter Ni-Fe Hydrogenase und Mrp Na+/H+ Antiportern, den evolutionären Vorgängern von Komplex I. Sie bieten uns wichtige mechanistische Modelle für den Vergleich mit Komplex I. Hydrogenase ist auch für die Biobrennstoffindustrie von großer Bedeutung. Mrp Antiporter sind für das Überleben vieler Krankheitserreger wichtig, wodurch sie potenzielle Ziele für antibiotische Medikamente darstellen.

Ausgewählte Publikationen

  1. Fiedorczuk, K., Letts, J. A., Degliesposti, G., Kaszuba, K., Skehel, M. and Sazanov, L. A. Atomic structure of the entire mammalian mitochondrial complex I. Nature, 538, 406-410, (2016).
  2. Letts, J. A., Fiedorczuk, K. and Sazanov, L. A. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature, 537, 644-648, (2016).
  3. Baradaran, R., Berrisford, J.M., Minhas, G. S. and Sazanov, L.A. (2013) Crystal structure of the entire respiratory complex I. Nature, 494, 443-8.
  4. Efremov, R. G. and Sazanov, L. A.  (2011) Structure of the membrane domain of respiratory complex I. Nature, 476, 414-20.
  5. Efremov, R.G., Baradaran, R. and Sazanov, L.A. (2010) The architecture of respiratory complex I, Nature, 465, 441-445.
  6. Sazanov, L.A. and Hinchliffe, P. (2006) Structure of the hydrophilic domain of respiratory complex I from Thermus thermophilus.  Science 311, 1430-1436.
  7. Hinchliffe, P. and Sazanov, L.A. (2005) Organization of iron-sulfur clusters in respiratory complex I. Science 309, 771-774.

Karriere

Ab 2015 Professor, IST Austria
2006 Programme leader, MRC Mitochondrial Biology Unit, Cambridge, UK
2000 Group leader, MRC Mitochondrial Biology Unit, Cambridge, UK
1997 Research Associate, MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK
1994 Research Fellow, Dept. of Biochemistry, Imperial College, London, UK
1992 Post-doc, School of Biochemistry, University of Birmingham, UK
1990 Post-doc, Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Moscow State University, Russia
1990 Ph. D. in Biophysics, Moscow State University, Russia

Ausgewählte Auszeichnungen

2013 Member of Faculty of 1000
2012 EMBO Grant
2009 AMGEN Grant
2004 Royal Society Grant
2002 Royal Society Grant
1992 Wellcome Trust fellowship

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